Святыня появилась на Руси в середине XVII века. По преданию, она была привезена из Константинополя и подарена отцу Петра I, Алексею Михайловичу (Тишайшему) патриархом Афанасием. С тех пор икона считалась покровительницей и особым царьградским благословением царствующему дому Романовых.
По высочайшему повелению императрицы Елизаветы в Царском селе специально для этой иконы была построена церковь. У святыни после этого появилась приставка — Царскосельская, а церковь, соответственно, стала Знаменской.
Предания сохранили сотни рассказов об исцелении, утешении, и даже спасении от неправедного суда после совершения молитвы перед иконой Знамения Божией Матери. Говорят, что когда в 1831 году в России вспыхнула эпидемия холеры, а в столице умирало до 600 человек в день, в Царском Селе не заболел и не умер ни один человек. Все население загородной царской резиденции собралось в церкви и возносило молитвы о спасении.
Особой почитательницей чудотворной иконы была жена последнего российского императора Николая II Александра Федоровна. Именно по ее настоянию икона была впервые почищена и отреставрирована.
Икону пытались вывезти из страны в 1944 году. Но святыню случайно обнаружили в Риге, в брошенном обозе, и вернули.
Весной 1948 года Царскосельская Икона Знамения Божией Матери была передана Митрополиту Ленинградскому и Новгородскому Григорию и с тех пор находится в церкви Санкт-Петербургской Духовной академии.